L'espressione genica nelle cellule eucariotiche è modulata da meccanismi complessi. Negli ultimi anni è emersa l'importanza fondamentale dei meccanismi post-trascrizionali nella regolazione dell'espressione genica, nel controllo di qualità e nella determinazione della variabilità del proteoma. Tuttavia, molti aspetti di questo complesso "network" di regolazione devono essere ancora chiariti, ed alcuni di essi saranno oggetto di studio nel nostro progetto. In questo contesto, proponiamo i geni di fattori della coagulazione, i cui livelli sono finemente modulati per garantire l'equilibrio emostatico, come modelli per lo studio di meccanismi regolatori a differenti livelli, dallo splicing, alla degradazione dell'mRNA ed alla terminazione della traduzione. I geni di diversi fattori della coagulazione sono soggetti a splicing alternativo (AS), e possono dare origine ad isoforme proteiche con caratteristiche strutturali e biochimiche distinte. In questo progetto studieremo nel dettaglio l'impatto dell'AS sull'espressione e la funzione di alcuni geni della coagulazione: i fattori V (FV), VII (FVII) e XI (FXI) e i geni per le catene del fibrinogeno. I meccanismi che regolano l'AS saranno analizzati in condizioni sia fisiologiche che patologiche; inoltre, le proprietà funzionali delle isoforme di splicing saranno investigate sia a livello di mRNA che di proteina. L'AS sarà analizzato anche per il suo possibile ruolo nella regolazione dell'espressione genica attraverso l'accoppiamento con il Nonsense Mediated mRNA Decay (NMD), il così detto pathway "RUST" (Regulated Unproductive Splicing and Translation). Modelli ex-vivo di inclusione o salto di esoni, prodotti sulla base di mutanti spontanei identificati tramite screening di ampie coorti di pazienti affetti da coagulopatie ereditarie rare, saranno usati per identificare e caratterizzare fattori di regolazione dello splicing che agiscono in-cis o in-trans. Gli obiettivi principali di questa parte del progetto saranno: 1. la caratterizzazione qualitativa e quantitativa del profili di splicing alternativo; 2. lo studio dei possibili ruoli fisiologici e fisiopatologici delle isoforme di splicing (AS in-frame e out-of-frame); 3. l'analisi del ruolo dell'NMD nella modulazione di trascritti fisiologici e di messaggeri recanti codoni prematuri di stop; 4. lo studio di elementi regolatori dello splicing in-cis ed in-trans attraverso l'uso di modelli ex-vivo derivati da mutanti spontanei. Anche il processo di terminazione della traduzione è cruciale per la corretta espressione genica. L'errata incorporazione di un aminoacido a livello di un codone di stop (readthrough) avviene con una frequenza di 10(-4). Il readthrough del codone di stop è fortemente influenzato dalle sequenze fiancheggianti, ma i dettagli sono solo parzialmente noti. A questo proposito investigheremo un numero consistente (n°15) di mutazioni nonsenso nel fattore IX della coagulazione (FIX), per le quali il readthrough comporterebbe aumenti di proteina plasmatica e miglioramenti nel fenotipo dei pazienti. La precisa misurazione nei pazienti dei livelli di FIX circolante, grazie a saggi fluorogenici ottimizzati per questa proteina, e di mRNA, permetterà la stima dell'efficienza del readthrough in vivo, e fornirà informazioni sui determinanti di sequenza nell'uomo. Studi di espressione associati a mutagenesi e studi funzionali permetteranno di validare questi dati ed anche di investigare le conseguenze del readthrough a livello proteico, un aspetto di grande rilevanza ma ancora inesplorato. Similmente verrà studiato il readthrough indotto da aminoglicosidi. Attraverso indagini in vivo, in modelli cellulari e in vitro, questo studio integrato chiarirà meccanismi ed interazioni molecolari alla base del controllo dell'espressione genica in condizioni fisiologiche e patologiche. I risultati amplieranno le conoscenze sui processi che garantiscono l'equilibrio emostatico in differenti condizioni. Accanto a questo, ed alla disponibilità di protocolli per lo studio di questi aspetti in altri geni, ci si attende di fornire approcci per la modulazione del processamento di mRNA (snRNA modificati) o del readthrough (aminoglicosidi), potenzialmente utili per la correzione di mutazioni di splicing e nonsenso, cause frequenti di malattie ereditarie nell'uomo.
POST-TRANSCRIPTIONAL AND TRANSLATIONAL MECHANISMS UNDERLYING THE REGULATION OF GENE EXPRESSION IN PHYSIOLOGICAL AND PATHOLOGICAL CONDITIONS- progetto PRIN
PINOTTI, Mirko
2008
Abstract
L'espressione genica nelle cellule eucariotiche è modulata da meccanismi complessi. Negli ultimi anni è emersa l'importanza fondamentale dei meccanismi post-trascrizionali nella regolazione dell'espressione genica, nel controllo di qualità e nella determinazione della variabilità del proteoma. Tuttavia, molti aspetti di questo complesso "network" di regolazione devono essere ancora chiariti, ed alcuni di essi saranno oggetto di studio nel nostro progetto. In questo contesto, proponiamo i geni di fattori della coagulazione, i cui livelli sono finemente modulati per garantire l'equilibrio emostatico, come modelli per lo studio di meccanismi regolatori a differenti livelli, dallo splicing, alla degradazione dell'mRNA ed alla terminazione della traduzione. I geni di diversi fattori della coagulazione sono soggetti a splicing alternativo (AS), e possono dare origine ad isoforme proteiche con caratteristiche strutturali e biochimiche distinte. In questo progetto studieremo nel dettaglio l'impatto dell'AS sull'espressione e la funzione di alcuni geni della coagulazione: i fattori V (FV), VII (FVII) e XI (FXI) e i geni per le catene del fibrinogeno. I meccanismi che regolano l'AS saranno analizzati in condizioni sia fisiologiche che patologiche; inoltre, le proprietà funzionali delle isoforme di splicing saranno investigate sia a livello di mRNA che di proteina. L'AS sarà analizzato anche per il suo possibile ruolo nella regolazione dell'espressione genica attraverso l'accoppiamento con il Nonsense Mediated mRNA Decay (NMD), il così detto pathway "RUST" (Regulated Unproductive Splicing and Translation). Modelli ex-vivo di inclusione o salto di esoni, prodotti sulla base di mutanti spontanei identificati tramite screening di ampie coorti di pazienti affetti da coagulopatie ereditarie rare, saranno usati per identificare e caratterizzare fattori di regolazione dello splicing che agiscono in-cis o in-trans. Gli obiettivi principali di questa parte del progetto saranno: 1. la caratterizzazione qualitativa e quantitativa del profili di splicing alternativo; 2. lo studio dei possibili ruoli fisiologici e fisiopatologici delle isoforme di splicing (AS in-frame e out-of-frame); 3. l'analisi del ruolo dell'NMD nella modulazione di trascritti fisiologici e di messaggeri recanti codoni prematuri di stop; 4. lo studio di elementi regolatori dello splicing in-cis ed in-trans attraverso l'uso di modelli ex-vivo derivati da mutanti spontanei. Anche il processo di terminazione della traduzione è cruciale per la corretta espressione genica. L'errata incorporazione di un aminoacido a livello di un codone di stop (readthrough) avviene con una frequenza di 10(-4). Il readthrough del codone di stop è fortemente influenzato dalle sequenze fiancheggianti, ma i dettagli sono solo parzialmente noti. A questo proposito investigheremo un numero consistente (n°15) di mutazioni nonsenso nel fattore IX della coagulazione (FIX), per le quali il readthrough comporterebbe aumenti di proteina plasmatica e miglioramenti nel fenotipo dei pazienti. La precisa misurazione nei pazienti dei livelli di FIX circolante, grazie a saggi fluorogenici ottimizzati per questa proteina, e di mRNA, permetterà la stima dell'efficienza del readthrough in vivo, e fornirà informazioni sui determinanti di sequenza nell'uomo. Studi di espressione associati a mutagenesi e studi funzionali permetteranno di validare questi dati ed anche di investigare le conseguenze del readthrough a livello proteico, un aspetto di grande rilevanza ma ancora inesplorato. Similmente verrà studiato il readthrough indotto da aminoglicosidi. Attraverso indagini in vivo, in modelli cellulari e in vitro, questo studio integrato chiarirà meccanismi ed interazioni molecolari alla base del controllo dell'espressione genica in condizioni fisiologiche e patologiche. I risultati amplieranno le conoscenze sui processi che garantiscono l'equilibrio emostatico in differenti condizioni. Accanto a questo, ed alla disponibilità di protocolli per lo studio di questi aspetti in altri geni, ci si attende di fornire approcci per la modulazione del processamento di mRNA (snRNA modificati) o del readthrough (aminoglicosidi), potenzialmente utili per la correzione di mutazioni di splicing e nonsenso, cause frequenti di malattie ereditarie nell'uomo.I documenti in SFERA sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.
