Studio dell'attività antivirale indotta da CpG durante l'infezione con herpesvirus (PRIN).

Il sistema immunitario dei vertebrati ha evoluto un sistema di riconoscimento di sequenze dinucleotidiche non metilate (motivi CpG) come un segnale di pericolo che porta alla stimolazione dell'immunità innata. Questo riconoscimento è mediato da recettori molecolari denominati Toll-like 9 (TLR9). In risposta all'attivazione indotta da CpG, TLR9 origina una cascata di segnali che attiva diversi fattori trascrizionali, inducendo una risposta immunologica. Grazie a tale capacità di incrementare la risposta immunitaria adattativa, le sequenze CpG vengono attualmente già utilizzate come adiuvanti nella vaccinazione, ma si ipotizza anche una loro futura applicazione diretta come agenti antivirali poichè si è osservato che l'esposizione a sequenze CpG inibisce la replicazione virale nelle cellule infette. Dati promettenti sono stati ottenuti nei modelli murini e bovini. Ci proponiamo quindi di analizzare l'azione antivirale CpG-indotta in due diversi modelli: capra e uomo. Gli studi sulla capra, effettuati con l'herpesvirus 1 caprino (CpHV-1), consentiranno di capire se i dati ottenuti in altri modelli animali possano essere trasponibili anche nel modello della capra. In parallelo, gli studi in vitro con cellule ed herpesvirus umani, aiuteranno a chiarire i meccanismi intracellulari attraverso i quali si esplica la resistenza all'infezione virale CpG-indotta. Nella capra, l'effetto antivirale di diversi motivi CpG verrà studiato in cellule mononucleate da sangue periferico di capra (PBMC) infettate in vitro con CpHV-1. Le sequenze CpG (o sequenze di controllo non-CpG) verranno aggiunte ai PBMC a diverse concentrazioni 24 ore prima dell'infezione con CpHV-1. L'attivazione o la sovra-espressione di TLR9 verra' analizzata sia mediante immunofluorescenza (utilizzando uno specifico anticorpo anti-TLR9), che attraverso amplificazione genica del trascritto mediante PCR dopo retrotrascrizione (rtPCR) e Real Time PCR(RT-PCR). Le cellule saranno infettate a diversa molteplicità di infezione e raccolte a diversi tempi dopo l'infezione. La produzione di virus infettante verrà determinata tramite titolazione, e la replicazione virale verrà quantificata mediante RT-PCR. Inoltre, per determinare se l'inibizione si esplica a differenti stadi della trascrizione virale, i livelli di mRNA virale saranno analizzati mediante RT-PCR utilizzando primers specifici per un gene tardivo (gC) e per un gene precoce (DNA polimerasi) di CpHV-1. L'effetto immunoproliferativo CpG-indotto verrà determinato mediante saggi di riduzione di alamarBlue (un composto non citotossico che consente la misurazione spettrofotometrica della proliferazione cellulare), mentre la produzione CpG-indotta di interferoni (IFN-alfa e IFN-gamma) verrà analizzata utilizzando kit ELISA specifici per l'interferone bovino. Mediante questi esperimenti sarà possibile caratterizzare la risposta CpG-indotta in vitro (attività antivirale, effetto immunoproliferativo, produzione di IFN), identificando quindi il/i motivi CpG più idonei per l'utilizzo in vivo negli studi di immunizzazione che saranno condotti dal gruppo della Prof.ssa Tempesta. Poichè i reagenti disponibili per studiare la risposta CpG-indotta nelle cellule di capra sono scarsi, ci proponiamo di condurre in parallelo anche studi sull'attività antivirale CpG-indotta in cellule umane infettate con herpesvirus umani. Dati ottenuti in precedenza nel nostro laboratorio, e dati di letteratura, indicano infatti che le sequenze CpG hanno effetto antivirale nel modello umano. Utilizzeremo lo stesso approccio sperimentale già collaudato per infettare PBMC umani, precedentemente stimolati con CpG, con il virus dell'herpes simplex di tipo 1 ceppo F. Inoltre, esperimenti preliminari non pubblicati ottenuti nel nostro laboratorio mostrano che PBMC ottenuti da pazienti con specifiche patologie autoimmuni non rispondono all'induzione antivirale stimolata dal CpG, contrariamente a quanto osservato in PBMC di donatori sottoposti alle stesse condizioni sperimentali. Ci proponiamo quindi di analizzare il diverso pattern trascrizionale dei PBMC dei pazienti e dei donatori dopo stimolazione con CpG, utilizzando il sistema RT2 Profiler PCR array (Superarray Inc). Questo sistema rappresenta il mezzo ideale per monitorare i profili di espressione di geni che codificano molte molecole immunologicamente importanti quali interleuchine, chemochine, recettori e markers di attivazione linfocitaria. Mediante il sistema Human Toll-Like Receptor (TLR) Signaling pathway RT2Profiler PCR Array, analizzeremo l'espressione di 84 geni associati alla trasduzione del segnale mediata da TLR, utilizzando la tecnologia di RT- PCR. Questo tipo di analisi metterà in luce le differenze presenti nei signaling intracellulari tra pazienti e donatori. I risultati saranno confermati da specifici studi di trascrizione mediante rtPCR e Northern Blot e saranno importanti nel delucidare i meccanismi molecolari alla base dell'attività antivirale CpG-indotta.