PRIN 2007 - Unità locale UniFE nell'ambito del progetto nazionale "Accumumulo e turnover di proteine nelle piante" (Coordinatore, T. Morosinotto, UniPD). Le microalghe presentano frequentemente pronunciate caratteristiche di plasticità metabolica, che si esprimono attraverso modificazioni fenotipiche ed interessano in primo luogo il sistema plastidiale. Tali modificazioni sono tese ad assicurare il mantenimento dell'attività fotosintetica anche in condizioni di stress. Inoltre, le microalghe sono in genere facilmente gestibili in termini di coltivazione e raggiungono in taluni casi biomasse considerevoli in tempi relativamente brevi. Per tali motivi, sono di grande interesse le ricerche volte a sfruttare le capacità di bioaccumulo di sostanze in microalghe ad alta produttività, anche ricorrendo a protocolli di trasformazione genetica. Nelle microalghe, il cloroplasto può rappresentare un interessante comparto in cui indurre l'accumulo di sostanze d'interesse, tra cui carotenoidi. Compiti della UO FE sono: (a) ottenere trasformati di Chlamydomonas reinhardtii e di altre microalghe verdi che sovraesprimano enzimi delle vie carotenogeniche, inducendo in tal modo un accumulo di carotenoidi nel plastidio; (b) verificare se tale accumulo influisce negativamente sull'assemblaggio tilacoidale, sull'attività fotosintetica, nonché sulla capacità riproduttiva delle microalghe. Un mutante privo di parete di C. reinhardtii verrà trasformato utilizzando il metodo "glass beads"; in particolare, si effettuerà una co-trasformazione per ottenere cellule che esprimano enzimi carotenogenici sotto il controllo di promotori forti e costitutivi (tubulina beta-2 e CaMV35S). Il metodo sarà esteso anche ad altre microalghe verdi private della parete cellulare mediante trattamento enzimatico. Per la trasformazione di alghe intatte verrà inoltre messa a punto la metodica che fa uso di Agrobacterium tumefaciens, recentemente impiegata anche per le microalghe. Grazie alla collaborazione con UO PG, oltre a trasformati nucleari, si otterranno anche trasformati plastidiali impiegando metodi biobalistici: in tal caso i geni saranno direttamente espressi nel plastidio. Con i diversi metodi, si otterranno microalghe che incorporano transgeni di enzimi chiave, quali PSY, ciclasi, ZE, NS, e che, presumibilmente, presentano nel cloroplasto un incremento sia del contenuto complessivo in carotenoidi, sia di carotenoidi specifici. Tecniche immunologiche, spettrofotometriche ed HPLC, condotte in collaborazione con UO VR e UO PD, permetteranno di ottenere informazioni sul contenuto e sulla localizzazione cellulare di tali enzimi, nonché sull'accumulo e la tipologia dei carotenoidi prodotti. L'attenzione sarà poi rivolta all'organizzazione tilacoidale, per verificare se e come l'introduzione di tali transgeni nel cloroplasto ed il conseguente accumulo di carotenoidi influiscano sull'assetto tilacoidale. Poiché i carotenoidi sono molecole lipofile, si può infatti ipotizzare che il loro accumulo determinerà effetti sulla struttura e la funzione delle membrane fotosintetiche. Eventuali alterazioni a livello dei fotosistemi e delle loro antenne saranno valutati mediante metodi biochimici, fluorimetrici ed ultrastrutturali. Qualora l'assetto tilacoidale dell'alga trasformata fosse compromesso, si procederà anche sovraesprimendo la fibrillina, una proteina legante i carotenoidi tipica dei cromoplasti. In tal modo, fornendo ai carotenoidi una localizzazione alternativa alle membrane tilacoidali, la funzionalità fotosintetica non risulterà compromessa, presupposto necessario in vista di applicazioni su vasta scala.

PRIN 2007 - Effetti della sovraespressione di enzimi carotenogenici in microalghe

PANCALDI, Simonetta
2008

Abstract

PRIN 2007 - Unità locale UniFE nell'ambito del progetto nazionale "Accumumulo e turnover di proteine nelle piante" (Coordinatore, T. Morosinotto, UniPD). Le microalghe presentano frequentemente pronunciate caratteristiche di plasticità metabolica, che si esprimono attraverso modificazioni fenotipiche ed interessano in primo luogo il sistema plastidiale. Tali modificazioni sono tese ad assicurare il mantenimento dell'attività fotosintetica anche in condizioni di stress. Inoltre, le microalghe sono in genere facilmente gestibili in termini di coltivazione e raggiungono in taluni casi biomasse considerevoli in tempi relativamente brevi. Per tali motivi, sono di grande interesse le ricerche volte a sfruttare le capacità di bioaccumulo di sostanze in microalghe ad alta produttività, anche ricorrendo a protocolli di trasformazione genetica. Nelle microalghe, il cloroplasto può rappresentare un interessante comparto in cui indurre l'accumulo di sostanze d'interesse, tra cui carotenoidi. Compiti della UO FE sono: (a) ottenere trasformati di Chlamydomonas reinhardtii e di altre microalghe verdi che sovraesprimano enzimi delle vie carotenogeniche, inducendo in tal modo un accumulo di carotenoidi nel plastidio; (b) verificare se tale accumulo influisce negativamente sull'assemblaggio tilacoidale, sull'attività fotosintetica, nonché sulla capacità riproduttiva delle microalghe. Un mutante privo di parete di C. reinhardtii verrà trasformato utilizzando il metodo "glass beads"; in particolare, si effettuerà una co-trasformazione per ottenere cellule che esprimano enzimi carotenogenici sotto il controllo di promotori forti e costitutivi (tubulina beta-2 e CaMV35S). Il metodo sarà esteso anche ad altre microalghe verdi private della parete cellulare mediante trattamento enzimatico. Per la trasformazione di alghe intatte verrà inoltre messa a punto la metodica che fa uso di Agrobacterium tumefaciens, recentemente impiegata anche per le microalghe. Grazie alla collaborazione con UO PG, oltre a trasformati nucleari, si otterranno anche trasformati plastidiali impiegando metodi biobalistici: in tal caso i geni saranno direttamente espressi nel plastidio. Con i diversi metodi, si otterranno microalghe che incorporano transgeni di enzimi chiave, quali PSY, ciclasi, ZE, NS, e che, presumibilmente, presentano nel cloroplasto un incremento sia del contenuto complessivo in carotenoidi, sia di carotenoidi specifici. Tecniche immunologiche, spettrofotometriche ed HPLC, condotte in collaborazione con UO VR e UO PD, permetteranno di ottenere informazioni sul contenuto e sulla localizzazione cellulare di tali enzimi, nonché sull'accumulo e la tipologia dei carotenoidi prodotti. L'attenzione sarà poi rivolta all'organizzazione tilacoidale, per verificare se e come l'introduzione di tali transgeni nel cloroplasto ed il conseguente accumulo di carotenoidi influiscano sull'assetto tilacoidale. Poiché i carotenoidi sono molecole lipofile, si può infatti ipotizzare che il loro accumulo determinerà effetti sulla struttura e la funzione delle membrane fotosintetiche. Eventuali alterazioni a livello dei fotosistemi e delle loro antenne saranno valutati mediante metodi biochimici, fluorimetrici ed ultrastrutturali. Qualora l'assetto tilacoidale dell'alga trasformata fosse compromesso, si procederà anche sovraesprimendo la fibrillina, una proteina legante i carotenoidi tipica dei cromoplasti. In tal modo, fornendo ai carotenoidi una localizzazione alternativa alle membrane tilacoidali, la funzionalità fotosintetica non risulterà compromessa, presupposto necessario in vista di applicazioni su vasta scala.
2008
Pancaldi, Simonetta
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Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/11392/1378394
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